Исидор Анненский родился 13 марта 1906 года в Ольвиополе (ныне Первомайск, Украина). Учился в четырёхклассной казённой прогимназии, затем в профтехшколе в Одессе.
После окончания театральной школы Бориса Лоренцо в Одессе (1922) работал актёром и режиссёром театра «Массодрам» (Мастерская социалистической драматургии) там же, с 1924 года в Одесском городском театре под руководством Н. И. Собольщикова-Самарина, затем на Кавказских Минеральных Водах, в театрах Архангельска, Ростова-на-Дону, Баку, в Московском театре Революции.
Окончив в 1934 году режиссёрский факультет ГИТИСа, а затем Киноакадемию при ГИКе (курс Сергея Эйзенштейна), самостоятельно поставил фильм «Медведь». Уже этот дипломный фильм принёс ему всесоюзную славу и считается самым успешным дебютом в истории отечественного кинематографа.
Впоследствии Анненский неоднократно обращался к экранизациям произведений А. П. Чехова и каждая картина становилась событием отечественного кинематографа — «Человек в футляре», «Свадьба», «Анна на шее», много работал в области экранизации русской литературной классики — «Княжна Мери» (по М. Ю. Лермонтову) и др., снимал ленты на современную тему — «Екатерина Воронина» и др.
Член Союза кинематографистов СССР с момента его основания.
В его картинах снимались крупнейшие актёры своего времени — М. И. Жаров, Ф. Г. Раневская, А. Н. Грибов, Н. П. Хмелёв, А. Н. Вертинский и многие другие. У него дебютировали в кинематографе актёры О. Н. Андровская, Л. И. Хитяева, Ю. М. Соломин, И. П. Мирошниченко и другие.
Исидор Анненский является автором сценариев почти всех поставленных им картин. Ленты сценариста и кинорежиссёра Исидора Анненского навсегда вошли в золотой фонд советского российского кино, о его творчестве рассказывается во всех энциклопедических изданиях по кинематографу, материалы о нём хранятся в Музее Кино в Москве. Им был прочитан курс лекций в ГИТИСе, на сценарном отделении и на режиссерском отделении Высших курсов сценаристов и режиссёров.
В автобиографической книге И. Анненского «В театре и кино» (Москва; изд. БПСК, 1974) раскрываются уникальные подробности рождения его широко известных фильмов, описывается атмосфера, в которых они создавались, говорится о методах отбора и режиссёрских принципах работы с актёрами. В ней опубликованы редкие фотографии разных периодов развития отечественного кино.
За заслуги в области киноискусства ему было присвоено звание Заслуженного деятеля искусств Российской Федерации.
И. М. Анненский умер 2 мая 1977 года в подмосковном Доме творчества кинематографистов «Болшево». Похоронен в Москве на Троекуровском кладбище.